蛋白质印迹法实验指南：第1部分，实验原理和样品准备

蛋白质印迹法（Western Blotting）的6个基础步骤：1.样品制备2.通过凝胶电泳分离蛋白质 3.蛋白质转移（电印迹）到膜上 4.膜封闭 5.免疫检测6.靶蛋白显印
WB法可用于检测天然和合成来源的蛋白质。来自表达系统的重组蛋白和来自生物样品的内源蛋白都可以用蛋白质印迹法检测。
对于要通过WB分析的蛋白质，首先必须要处含有目标蛋白的样品，以使目标蛋白质可用于分析。例如，在筛选表达时，通过裂解细胞来释放蛋白质，使其进入分离基质。
蛋白质提取之后可以进变性和还原，目的是将蛋白质分解成一级结构，因此蛋白质在电泳期间可以根据不同的分子分离。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺变性凝胶电泳 (SDS-PAGE) 使用Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide（SDS）包裹蛋白质，掩盖蛋白质固有的电荷并赋予它们大小成正比的整体均匀电荷。
接着要使用凝胶电泳将蛋白质分离，将样品加载到凝胶中，并施加电压，蛋白质向正极迁移。凝胶的密度阻碍了它们的迁移，使它们能够按大小分开。分离后，通过将凝胶和膜直接接触并施加电场将蛋白质拉入基质中的原理，将蛋白质转移（electroblotted，电印迹）到膜上。
蛋白质转移之后是膜封闭步骤，该步骤使用蛋白质溶液来最大限度地减少非特异性相互作用。然后将膜与特异性结合目标蛋白质的一抗一起孵育。在进一步的封闭步骤之后，偶联的二抗与一抗结合，从而使靶蛋白可视化。
比色或化学发光底物都可用于显示来自报告酶偶联物的信号。使用成像设备检测来自荧光染偶联物的信号，并可用于同时检测多个目标。
WB是一种常规实验室程序，可以检测和分析许多蛋白质及其相互作用。WB的成功取决于抗体抗原相互作用的特异性以及二抗的信号放大潜。这些因素使蛋白质印迹极其敏感，能够检测低至匹克（picogram）水平的蛋白质。根据试剂类型和检测方法，可以得到半定量和定量的检测结果。
WB法可以高效可靠地进，以产生高质的印迹。本指南将帮助您选择正确的试剂、合适的抗体和检测方法，并协助您排除一些常见的实验故障。
一、样品制备在电泳过程中准确分离蛋白质是蛋白质印迹的关键步骤。它依赖于样品的正确处，以目标蛋白质成为可以通过凝胶进行迁移的形式。
各种样本来源的蛋白质均可以通过蛋白质印迹分析法来分析，如哺乳动物、细菌细胞培养物，或来自临床组织样品，每种样品都需要同的处来产生最终用途的优质蛋白质。不同蛋白质的提取方法详见下表；然而，对于WB法，通常可能并需要如此严格地处方法。

由于免疫印迹的特异性，可以对用于蛋白质印迹的样品进粗略处，以提取蛋白质并将其转移到适合将样品引入分离凝胶进电泳的溶液中。由于存在诸如DNA之类的聚合生物分子，粗制样品尤其可能是粘性的，并且可能会影响凝胶加载。
例一：针对细菌培养样品的制备工艺1.取1ml大肠杆菌培养物样品并转移到冰上的微离心管中。2.在4°C下以13,000rpm转速旋转2分钟。3.弃去上清液。4.在50l上样缓冲液中重悬细胞，并在100°C下煮沸5分钟。5.3,000rpm离心5分钟。6.上样
例二：贴壁细胞例如哺乳动物(HEK293)的示例样品制备。 1.将组织培养板置于冰上，用冰冷的PBS清洗细胞。2.吸出PBS，然后加入适的裂解缓冲液（例如1mL/107个细胞/100mm培养皿150cm烧瓶；每5×106个细胞/60mm培养皿/75cm烧瓶0.5mL）。3.使用细胞刮刀从孔/烧瓶中分离细胞，然后用移液器吸头或通过胰蛋白酶化。4.将细胞悬液转移到预冷的微离心管中。5.然后在4°C下对样品进微离心。条件取决于细胞类型，应根据您的实验设置确定。例如，HEK293可以在1000rpm下耐受15分钟。6.从沉淀的细胞中吸出上清液并转移到冰上的新试管中。7.将负载染加入上清液并在100°C下煮沸5分钟。8.细胞沉淀也可与上清液一起上样染。
将样品以13,000 rpm的速度旋转5分钟，然后上样到凝胶中进电泳。
二、裂解和溶解为了使蛋白质能够进入分离凝胶，必须将样本进行裂解，因此样品制备的第一阶段是裂解。通过裂解提取细胞内表达的蛋白质，裂解会破坏细胞的质膜和/或细胞壁，以释放蛋白质。细胞外表达（分泌）的蛋白质需要裂解，尽管可以对细胞进处以观察由于合成当而捕获的蛋白质。
大规模蛋白质纯化——提取方法可以通过蛋白质印迹分析来自各种来源的蛋白质。样品可能来自蛋白表达系统，例如哺乳动物或细菌细胞培养物，或来自临床组织样品，每种都需要同的处来产生可用的印迹。
用于蛋白质提取的方法取决于样品的性质。蛋白质表达在哺乳动物、昆虫、细菌和酵母等同类型的细胞中进，一些样本可能来自组织；这些样本具有结构特异性因此需要实施同的处方式。
分泌蛋白哺乳动物或昆虫细胞系统中的一些蛋白质可能在上清液中表达，因此需要从细胞中提取。 tip：保留上清液样本，并在筛选表达时将其上样至细胞裂解液旁边的凝胶上。
筛选和处理蛋白质表达通常通过western blotting进行筛选。例如，几个克隆的表达可以进行相互比较，或者它们在同表达系统中具有不同的表达。在这些筛选试验中，从蛋白质样本中取出样品并上样用于分析。通常会将上清液与细胞沉淀进比较，以定位表达发生的位置。 Coomassie染色所观察到的总蛋白可以与在western blot中特异性检测到的靶点蛋白的表达进行比较。筛选试验中进的基本处可能能代表最终表达是如何处以供最终使用的，例如晶体学试验需要更精细的纯化步骤。

图 1：在一系列细胞裂解物中检测 His 标签蛋白。以100 ng的浓度将C末端His-Tagged蛋白添加到细胞裂解物中。将HEK 293、CHO、BL21 E.Coli和Sf9昆虫细胞的细胞裂解物还原并在100°C下煮沸5分钟，然后以9μg/孔的速度加载到联SDS凝胶中。A.蛋白质印迹。将凝胶电印迹到硝酸纤维素膜上，用PBS/0.2% Tween 20中的5% BSA封闭，并用Jackson ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240)探测以1:20K稀释并使用数字成像仪进可视化。 B.凝胶用Coomassie染色。
三、裂解缓冲液裂解缓冲液的目的是破坏细胞膜以释放蛋白质。裂解缓冲液通常包括破坏细胞膜脂质双层并形成胶束的去污剂。有许多缓冲液配方已经过验证，可用于同的细胞类型或蛋白质表达位置，例如裂解液RIPA或NP-40。材的加工应在冰上进，以尽减少因细胞成分带来的对蛋白质降解和变性。
蛋白酶及其抑制 溶解的方法，如涉及到对细胞的机械破坏过程，会导致细胞内蛋白酶的释放。这些蛋白酶可以消化和截断感兴趣的蛋白质，这可能会导致在膜上观察到多个条带。
蛋白质对蛋白酶的敏感性取决于它们的氨基酸组成，细胞内蛋白质比细胞表面或细胞外蛋白质的抵抗力低。膜蛋白被洗涤剂溶解时，特别容易被蛋白酶降解。生物信息学工具可以提前预测蛋白质对蛋白质水解的敏感性。蛋白酶抑制剂可用于防止蛋白质水解;它们可以是化学抑制剂和酶抑制剂的混合物，可以加入裂解缓冲液中，然后再加入细胞或储存蛋白质的缓冲液中。
有一系列的抑制剂可以对常见种类的丝氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸蛋白酶，以及米诺肽酶和金属蛋白酶起效。不同的表达系统或对蛋白质活性抑制的敏感性可能会阻止某些抑制剂的使用。通常可使用蛋白酶抑制剂的专有混合物，或单独的试剂也可以应用。
在缓冲液选择上，叠氮也可以是蛋白酶的来源以防止细菌生长。去磷酸化可能发生在细胞被裂解之后。如果磷酸化的蛋白是western blotting的目标蛋白，那么磷酸酶抑制剂，如钒酸钠（sodium vanadate），也应该添加到裂解缓冲液。样品应在整个样品制备过程中冷藏，以尽量减少降解和去磷酸化的可能性。
下表列出了一些抑制剂和添加剂的例子：

pH裂解缓冲液的pH值对于样品制备过程中的控制很重要，以确保稳定性和蛋白质的活性得以维持。通过使用正确pH值的缓冲液，可确保蛋白质稳定性和溶解度，防止聚集和沉淀。与稳定性相关的是蛋白质的活性。使用正确的pH值可确保留蛋白质以供下游使用。
缓冲液的pH值通常比蛋白质等电点高或低一个pH单位，通常在pH6和8之间的生范围内。使用含有弱酸与其共轭碱的组合，或弱碱与其共轭酸的组合。下表为大家列出了常见缓冲液及它们的pH范围。

Tween试剂非离子洗涤剂可用于增加非极性、不溶性蛋白质的溶解度。例如TritonX-100和Tween(r) - 20。
渗透压稳定剂 当从特定的亚细胞结构中纯化蛋白质时，例如来自真核细胞的细胞器、脂质膜或来自细菌周质空间的蛋白质，在细胞裂解步骤中需要加入渗透稳定剂，例如高浓度的蔗糖。它们的加入有助于在裂解过程中稳定亚细胞结构，还可以防止细胞壁降解过程中的细胞裂解。
在分离出的亚细胞结构的特定重力下进行离心，并加入密度梯度(如蔗糖或甘油分馏)，通常在western blotting前进一步富集亚细胞结构中的蛋白质。
渗透稳定剂的存在可能会影响蛋白质在凝胶上的迁移方式，并且样品可能需要在上样前稀释到同渗透强度的缓冲液中。
盐类添加盐以改变缓冲溶液的离子强度。加盐可提高蛋白质溶解度；然而，过多的盐会降低溶解度并使蛋白质沉淀。
通过优化溶液的离子强度，可以励蛋白质保持其折叠构象，从而通过防止受攻击的内部残基来阻止蛋白水解造成的损害。表面电荷的稳定会阻止蛋白质聚集。
样品澄清使用离心来澄清样品。它可以在裂解后使用，从而将细胞裂解物以非常高的速度超速离心较长时间以沉淀细胞碎片和染色体DNA，然后将其丢弃并保留含有溶解蛋白质的溶液。
对于在细胞外表达到培养基中的蛋白质，例如在哺乳动物细胞中，必须调整离心的速度和持续时间，以提供破坏性较小的条件以防止细胞裂解。离心，通常通过密度梯度，也用于分离细胞部分。例如，微粒体（内质网、质膜）可以在初始澄清后通过低速离心以高速沉淀。
未正确澄清的裂解物和高NaCl浓度的细胞成分残留物可能导致SDS-PAGE期间样品中的蛋白质分离正确，从而导致条带模糊或蛋获得非目的分子量的蛋白。
核酸的存在也会堵塞孔并影响样品迁移，因此可以添加脱氧核糖核酸酶(DNase)以消除这种污染物。也可以进透析或凝胶过滤以降低NaCl浓度。这些净化技术能够在电泳过程中实现准确的分离
样品浓度想情况下，应在上样前使用Bradford、Lowry或二辛可宁酸(BCA)测定等方法来确定样品的总蛋白质浓度。预先确定的样品浓度使分离凝胶中的孔能够加载相同的体积和浓度，以优化整个凝胶的一致性。如果将过多的蛋白质装入孔中，则会影响相邻泳道中蛋白质的迁移，从而难以解释结果。
根据孔的大小，每条泳道10-50g的总蛋白量就足够了。但是，如果使用纯蛋白质，这个重量可能会过于浓缩。
低丰度蛋白可能需要浓缩，以便于western blot检测。纯化标记(如HIS6标记)允许使用亲和柱(如镍)浓缩蛋白质。确保洗脱缓冲液与加载缓冲液兼容是很重要的。另外，如果有针对特定蛋白质的抗体，可以使用免疫沉淀等方法有效地浓缩蛋白质。
蛋白质浓缩大型蛋白质制备通常需要在纯化步骤中进浓缩步骤，以将材体积减少到于管的尺寸。亲和、离子交换和金属色谱或切向流过滤可用于去除多余的液体体积并浓缩总蛋白或目标蛋白。 WB样品可能需要浓缩步骤，因为由于技术的敏感性，蛋白质的丰度太可能低于检测限。
最佳蛋白质浓度在孔中加载过多的蛋白质会导致蛋白质意外迁移，但设置当也会导致蛋白质迁移，例如当加载缓冲液中盐或变性剂（如盐酸胍）浓度过高时。此外，在凝胶或蛋白质印迹运期间过度升高温度的凝胶运条件（例如，运缓冲液中的电压或盐浓度过高）会对蛋白质分离产生负面影响。请参阅第4章，了解如何解决相关的技术问题。
下表列出了一些常见的样本准备问题

四、上样条件及缓冲液在上样之前，将样品与上样缓冲液混合，这有助于蛋白质变性和将样品上样到分离凝胶中。它通常是染、还原剂和变性剂以及甘油的组合。
然后将样品在100°C下煮沸5分钟，然后在上样前短暂离心。在某些情况下，对于高度疏水的整合膜蛋白，需要低于100°C的温度。
染色剂上样将加载染添加到样品中，以可视化电泳期间的加载和样品迁移。一种常用的上样缓冲液 Laemmli上样缓冲液是溴酚蓝、甘油、Tris、SDS和还原剂（如DTT或BME）的组合。由于体积小，溴酚蓝比样品中的蛋白质迁移速度快，并提供了一个迁移前沿来监测电泳过程并防止样品流失。如果遇到酸性条件，它也会变黄，表明缓冲系统足，或省略了处步骤。甘油使样品比运缓冲液稠密，使样品能够“下沉”到孔的底部。在加载缓冲液中煮沸样品后，将样品短暂离心。

五、氧化与还原条件通过WB分析的样品被变性和还原，以蛋白质在电泳过程中根据它们的分子进分解。添加还原剂，如β-巯基乙醇(BME)或二硫苏糖醇(DTT)，可减少半胱氨酸残基之间的二硫键。 SDS处通过破坏残基内和残基之间的非共价键使蛋白质变性，从而将蛋白质线性化为“松软”的氨基酸链。SDS还有效地饱和蛋白质的聚酰胺骨架，降低电荷对蛋白质迁移的影响。
六、注意事项样品的完全还原可能导致蛋白质无法按预期解析，这可能会被观察为拖尾条带或不理想大小的条带。因此，应在使用当天将新鲜的还原剂添加到加载缓冲液中。加热足也会导致样品完全变性。
七、天然或非还原凝胶非还原或天然凝胶用于观察蛋白质的天然为，例如它们的化学计或与溶液中其他蛋白质的相互作用。这些蛋白质通常通过考马斯或银染色而是免疫印迹来观察。在这种情况下，应将还原剂添加到加载缓冲液中，从加载和运缓冲液中去除SDS，并且要煮沸样品。表5根据所需的蛋白质状态详细说明了缓冲液中的成分。溴酚蓝通常也被添加到上样缓冲液中，以使凝胶电泳过程中的蛋白质迁移可视化。由于体积小，溴酚蓝比样品中的蛋白质迁移速度快。
下表比较了不同状态蛋白质和缓冲液组成：

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